De novo 从头测序是一种不依赖已知参考序列的序列解析方法。在蛋白和多肽分析中，它通常利用 LC-MS/MS 获取肽段碎片谱，再根据 b/y 离子系列、质量差和生物信息学算法推导氨基酸顺序。它适合未知蛋白测序、多肽序列确认、抗体序列解析、突变检测以及数据库不完整或无法直接匹配的样品。

关键要点

它是什么？

De novo 从头测序最早常用于基因组或转录组组装语境，在蛋白质谱中则指不直接依赖数据库匹配，而是从肽段碎片离子的质量差推断氨基酸顺序。对于没有参考序列、参考序列不完整、存在未知突变或需要确认抗体可变区序列的样品，De novo 分析能提供比常规数据库检索更灵活的序列证据。

蛋白 De novo 测序通常不是一次实验直接给出完整蛋白序列，而是先通过蛋白酶切产生多个重叠肽段，再采集 MS/MS 谱图，最后将可信肽段进行拼接、组装和反向验证。覆盖越完整、重叠片段越充分、谱图质量越高，最终序列解释越可靠。

图 1. De novo 测序根据 MS/MS 碎片离子之间的质量差推导肽段序列。

De novo 从头测序的基本流程

第一步是样品准备和纯度确认。复杂混合样品会显著增加拼接难度，因此未知蛋白或抗体样品通常需要先纯化、胶切或分级。第二步是多酶切设计，例如 Trypsin、Chymotrypsin、Glu-C、Asp-N 等可产生互补肽段，帮助覆盖单一酶切难以覆盖的区域。

第三步是 LC-MS/MS 数据采集，通过高分辨质谱获得母离子质量、碎片离子和谱图强度。第四步是 De novo 算法解析肽段序列，并结合质量准确度、离子连续性、修饰可能性和重叠区域进行筛选。最后，需要用反向验证、理论谱图匹配、完整分子量或相邻肽段证据检查拼接结果。

图 2. 多酶切、MS/MS 采集和重叠肽段拼接是从头测序可靠性的关键。

主要优势

1、不依赖完整数据库

当目标蛋白来源物种缺少数据库、序列发生突变或样品为未知多肽时，传统数据库检索可能无法给出结果。De novo 测序可直接从谱图推断序列，为后续数据库搜索、同源比对或功能分析提供线索。

2、适合未知蛋白、抗体和突变分析

抗体可变区、重组蛋白突变体、天然来源多肽和未知蛋白都可能存在参考信息不足的问题。从头测序可以帮助解析候选序列、识别突变位点，并辅助确认序列是否与预期一致。

3、可与常规质谱鉴定互补

De novo 结果可作为数据库检索的补充证据。对于部分匹配、低同源蛋白、变异肽段或修饰肽段，结合 De novo 片段解释与数据库检索通常比单一方法更稳妥。

主要限制或权衡

1、Leu/Ile 等同分异构氨基酸在常规 MS/MS 中难以直接区分。

2、低丰度肽段、碎片不连续或谱图噪声会影响序列推断。

3、翻译后修饰、二硫键和糖基化可能增加质量解释复杂度。

4、单一酶切容易产生覆盖缺口，完整序列解析通常需要多酶切策略。

5、De novo 结果需要反向验证，不能只依赖软件输出的最高分序列。

如何选择 De novo 测序方案？

如果目标是短多肽序列确认，重点是获得高质量 MS/MS 谱图并确认端基和修饰；如果目标是未知蛋白全序列分析，应优先进行高纯度样品制备、多酶切和重叠片段拼接；如果目标是单克隆抗体序列解析，需要结合轻链、重链、可变区覆盖和抗体特异性数据库策略；如果目标是突变检测，则应围绕理论序列和候选突变区域设计验证。

图 3. De novo 测序方案应根据样品类型、是否有参考序列和目标问题设计。

FAQ

1、De novo 测序完全不需要数据库吗？

De novo 推断本身不依赖数据库，但结果解释常常需要数据库、同源序列或理论分子量辅助验证。对于蛋白全序列项目，数据库和同源比对能帮助判断拼接结果是否合理。

2、De novo 测序能保证得到 100% 覆盖吗？

不能保证。覆盖度受蛋白酶切位点、肽段理化性质、修饰、样品量、仪器灵敏度和谱图质量影响。多酶切和反向验证可以提高覆盖度，但仍可能存在难以覆盖的区域。

3、Leu 和 Ile 能通过 De novo 测序区分吗？

常规 MS/MS 中 Leu 和 Ile 质量相同，通常难以直接区分。需要结合酶切特异性、同源序列、特殊碎裂方式或其他实验信息辅助判断。

4、抗体可以做 De novo 从头测序吗？

可以。单克隆抗体从头测序常用于可变区序列解析、抗体一致性确认和生物药研发支持。由于抗体结构复杂，通常需要多酶切、多维数据和严格的轻重链归属。

5、De novo 结果为什么需要反向验证？

从头测序依赖碎片谱推断，若谱图质量不足或片段拼接错误，可能出现看似合理但实际错误的序列。反向验证可通过理论谱图、重叠肽段、分子量和重复实验提高结果可信度。

结论

De novo 从头测序适合解决未知蛋白、多肽、抗体、突变体和数据库不完整样品的序列解析问题。可靠的从头测序不只依赖软件算法，更依赖样品纯度、多酶切覆盖、高质量 MS/MS 数据和反向验证。对于需要获得完整序列或关键突变信息的项目，应将 De novo 分析与常规质谱鉴定、分子量检测、同源比对和多轮验证结合使用，才能降低拼接错误并提高序列结论的可信度。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

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